IHC（免疫組化）融合了免疫學原理（抗原抗體特異性結合）和組織學技術（組織的取材、固定、包埋、切片、脫蠟、水化等），通過化學反應使標記抗體的顯色劑 （熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色，來對組織（細胞）內(nèi)抗原進行定位、定性及定量的研究（主要是定位）。IHC 實驗注意事項：

1. 組織取材

為避免蛋白丟失及組織受損引起的非特異試劑吸附，取材須快速（組織塊也不宜太大）且要盡量避免人為損傷。

2. 固定

固定要及時、，但也不能固定過久。實驗證明甲醛固定時間越久的組織越容易出現(xiàn)自發(fā)熒光及非特異性染色。一般以 12~36 小時*。

3. 石蠟片與冰凍片的選擇

石蠟片制作對設備要求較冰凍片低，組織結構更好，保存條件簡單時間也久。但對部分蛋白有較強烈的破壞作用，對蛋白保護較冰凍片差。冰凍片對蛋白的保護較石蠟片好，制作起來也較快。

4. 滅活

過氧化物酶（HRP）系統(tǒng)的一定要做內(nèi)源性過氧化物酶的滅活，而對于堿性磷酸酶（AP）系統(tǒng)和免疫熒光這個步驟不需要做。

5. 抗原修復

不同的樣本、不同的蛋白其*的抗原修復方式會有所區(qū)別，熱修復（酸性修復液（檸檬酸鹽修復液）、堿性修復液（EDTA 修復液）及酶修復（蛋白酶）都可做嘗試。對于陳舊的樣本要增加修復強度，比如延長修復時間。

6. 封閉

常用的封閉液有 5% BSA 和血清。BSA 是通用型的封閉液。血清應選擇與二抗同源的血清。

7. 抗體孵育

一抗一定要與實驗及樣本匹配的，孵育條件以 4 ℃ **。二抗應匹配一抗，37 ℃ 孵育半小時即可。

8. 顯色

DAB 顯色建議在鏡下控制反應時間，在陽性及背景之間選擇平衡點。

9. 結果觀察

建議在數(shù)據(jù)庫中查詢準確的表達部位。